Desde antes de la fundación de la ciudad de Panamá, el Istmo sería objeto de exploración, tránsito, y encuentros. La primera población en el continente que fue sembrada por los colonialistas españoles fue la población de Santa María la Antigua del Darién (1510), luego la población de Acla (1511), como cabezas de playa para la conquista y colonización.
La búsqueda de oro y esclavos se convirtió en el santo y seña de la empresa colonizadora y ello transformó radicalmente las originales estructuras precolombinas en esta parte del mundo.
Con la llegada de Pedro Arias de Avila, mejor conocido como Pedrarias Dávila, se inicia un proceso de poblamiento y conquista más acelerado y con mayor magnitud.
Pedrarias nacido en la región de Segovia, parte del reino de Castilla en 1440, y que se destacó por su combate contra los moros (participó en la guerra de Granada y en las campañas militares de Africa), fue nombrado gobernador y capitán general de Tierra Firme/Castilla del Oro así se le llamó al Istmo de Panamá y parte de Centroamérica.
Ese cargo fue ejercido por el conquistador español de 1513 a 1526. Pedrarias llega a Tierra Firme después de que Vasco Nuñez de Balboa hubiera logrado, ese mismo año de 1513, cruzar la selva de Darién para llegar a las costas de lo que denominaría Mar del Sur (Océano Pacífico).
Balboa, había nacido en la pequeña población de Jerez de los Caballeros en Badajoz, en 1475, y había arribado a nuestras tierras con la expedición de Rodrigo de Bastidas, a quien se considera el que encontró el Istmo, en 1501.
Balboa se estableció en la colonia de La Española (hoy República Dominicana), y permaneció allí hasta 1510. Mas fracasó en su intento de establecerse como colono. Escapa de sus acreedores en el barco de Fernández de Enciso, que seguía a Alonso de Ojeda en un viaje de colonización a Tierra Firme. Balboa participa en la fundación de Santa María la Antigua del Darién primer establecimiento en Tierra Firme.
Consiguió gracias a su dureza y extremada crueldad en su manejo de la colonización, el nombramiento de gobernador del Darién y fue colonizando palmo a palmo esa región. Por los caciques indígenas conoció la existencia de un mar (Océano Pacífico) y de tierras donde el oro era abundante (imperio incaico del Perú).
Atravesó el Istmo junto a una expedición militar de conquista (de las costas atlánticas, atravesando el Darién, hasta las costas pacíficas) y el 23 de septiembre de 1513 llegó al Pacífico y le dio el nombre de Mar del Sur.
Nombrado primero como adelantado del Mar del Sur, entra en disputa con Pedrarias, quien llega al Darién para suplantarlo. La disputa entre el adelantado y el nuevo gobernador llegó a su límite, y el gobernador Pedrarias le acusa de conspiración y le condena a muerte por lo cual es ejecutado en Acla en 1519.
Luego de ello el gobernador impuso una férrea disciplina en toda la Gobernación y emprendió varias expediciones, que le granjearon la fama de implacable o la ira de Dios.
El 15 de agosto de 1519, Pedrarias funda la Ciudad de Panamá en las costas del océano Atlántico, a la que transfirió luego la Capitanía, y dejó la Gobernación del Darién al mando de un subordinado. Luego de estabilizar la comunidad y regular el tráfico de las expediciones y guerra de conquista y colonización, emprende viaje de expedición y conquista hacia las tierras de Nicarao (hoy Nicaragua), previo paso por las tierras de los chorotegas hoy Costa Rica en 1522, que resultó un fracaso a medias, pero logra establecer plaza en Nicarao y fundar la población de León, en donde muere en 1531.
Es importante destacar que desde Panamá es que parte la expedición de conquista y colonización española del Imperio Incaico, organizada por Francisco Pizarro y Diego de Almagro. En la ciudad de Panamá se organiza la Real Audiencia (1580), de corta duración.
Es decir, la ciudad de Panamá, fue el centro de expediciones de conquista y colonización tanto de Centroamérica como Suramérica.
Además, la actividad transitista hizo del Istmo un punto donde se muestra que: los vecinos que ahora hay son contratantes y no piensan estar en ella más tiempo de cuanto puedan hacerse ricos, y así, idos unos, vienen otros y pocos o ningunos miran por el bien común.
La ciudad de Panamá fue destruida en 1668 por el pirata Henry Morgan. En 1671 fue trasladada a su actual sitio por el presidente de la Real Audiencia de Panamá, don Antonio Fernández de Córdoba, según Real Cédula, quien fundó la misma un 21 de enero de 1673, en las faldas del Cerro Ancón.